傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過(guò)程

實(shí)驗(yàn)原理
    傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。
    這種培養(yǎng)，*步也是制備細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層時(shí)，它很容易被蛋白水解酶和EDTA）所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA（乙二胺四乙酸鹽）的混合物，做為消化液。
    細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長(zhǎng)因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無(wú)菌條件。
主要試劑
L磷酸鹽緩沖液（PBS）
無(wú)鈣、鎂溶液
細(xì)胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA
EMEM液
3%谷氨酰胺
0.5％臺(tái)盤藍(lán)染液等
主要設(shè)備
    解剖剪、解剖鑷、眼科剪（尖頭、彎頭）、眼科鑷（尖頭、彎頭）、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均須*清洗、烤干、包裝好，9.9xl04Pa（15磅）滅菌30min備用。
    此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。
實(shí)驗(yàn)材料
喉癌細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)步驟
在做傳代細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞是否已長(zhǎng)成致密單層，如已長(zhǎng)成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
1. 營(yíng)養(yǎng)液配制:
EMEM液                                90%
犢牛血清                                10%
雙抗（1萬(wàn)單位／m1）                加至約100單位／m1
3％谷氛酞胺                           1m1
7.4％NaHCO3                         調(diào)pH至6.8—7.0
2. 換液:
在酒精燈旁打開(kāi)瓶塞，倒去瓶中的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液。
3. 消化與分裝
    在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動(dòng)，將溶液倒出。重復(fù)上述動(dòng)作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml加0.5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細(xì)胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)縫隙（針孔大小的空隙），如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進(jìn)行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時(shí)，可倒去消化液，加入新配制的營(yíng)養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營(yíng)養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層至瓶壁細(xì)胞全部脫落下來(lái)為止。此時(shí)，可繼續(xù)輕輕地吹打細(xì)胞懸液，以使細(xì)胞散開(kāi)。隨之進(jìn)行分裝。
4. 培養(yǎng)
    分裝好的細(xì)胞瓶上，做好標(biāo)志，注明細(xì)胞代號(hào)、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細(xì)胞均勻分布，以免堆積成團(tuán)。然后置于37℃培養(yǎng)。
5. 觀察
   1） 觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的幾個(gè)問(wèn)題；
細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察，觀察的重點(diǎn)如下：
      a. 首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度
      b. 觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細(xì)胞是否生長(zhǎng)。
      c. 如細(xì)胞已生長(zhǎng)，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長(zhǎng)階段。觀察時(shí)可參照2）的描述進(jìn)行。
      d. 觀察完畢，可用臺(tái)盤藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。以確定死、活細(xì)胞的比例。
   2） 細(xì)胞的生長(zhǎng)階段及其形態(tài)特征
傳代培養(yǎng)的細(xì)胞需逐日進(jìn)行觀察，注意細(xì)胞有無(wú)污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。—般中層培養(yǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)開(kāi)始，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)、繁殖、衰老及死亡的全過(guò)程。它是一個(gè)連續(xù)的生長(zhǎng)過(guò)程，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個(gè)時(shí)期，但各期間無(wú)明顯界限。現(xiàn)分別描述如下：
      a. 游離期：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，由于細(xì)胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細(xì)胞膜的彈性。所以，此時(shí)細(xì)胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)h。
      b. 吸附期（貼壁）：由于細(xì)胞的附壁持性，細(xì)胞懸液靜置培養(yǎng)一段時(shí)間（約7—8h）后，便附著在瓶壁上（此期不同細(xì)胞所需時(shí)間不同）。在顯微鏡下觀察時(shí)可見(jiàn)瓶壁上有各種形態(tài)的細(xì)胞，如圓形、扁形、短菱形。細(xì)胞的特點(diǎn)，大多立體感強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，透明。
      c. 繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細(xì)胞進(jìn)入繁殖期，加速了細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。此期包括由幾個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞島（即由少數(shù)細(xì)胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細(xì)胞群，常散在地分布在瓶壁上），到細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶壁（即所謂形成細(xì)胞單層）的過(guò)程。此期細(xì)胞形態(tài)為多角形（呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞的特征）。細(xì)胞特點(diǎn)：透明，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚，并可隱約見(jiàn)到細(xì)胞核。根據(jù)細(xì)胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長(zhǎng)狀況分為四級(jí)。以“十”的多少表示如下：
十：細(xì)胞占瓶壁有效面積（也就是細(xì)胞能生長(zhǎng)的瓶壁面積）的25％以內(nèi)有新生細(xì)胞。一般要觀察3—5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，然后加以綜合分析判斷。
十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的25—75％以內(nèi)具新生細(xì)胞。
十十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細(xì)胞。細(xì)胞排列致密。但仍有空隙。
十十十十：細(xì)胞占瓶壁95％以上，細(xì)胞已長(zhǎng)滿或接近長(zhǎng)滿單層，細(xì)胞致密，透明度好。
從十十一十十十十為細(xì)胞的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期（或稱為指數(shù)增長(zhǎng)期）。
      d. 維持期：當(dāng)細(xì)胞形成良好單層后，細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂都減緩，并逐漸停止生長(zhǎng)，這種現(xiàn)象被稱為細(xì)胞生長(zhǎng)的接觸抑制。此時(shí)細(xì)胞界限逐漸模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時(shí)營(yíng)養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。
      e. 衰退期：由于溶液中營(yíng)養(yǎng)的減少和日齡的增長(zhǎng)，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時(shí)細(xì)胞間可出現(xiàn)空隙，細(xì)胞中顆粒進(jìn)一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細(xì)胞經(jīng)固定染色處理后，可見(jiàn)細(xì)胞中有大而多的脂肪滴及液泡。zui后，細(xì)胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來(lái)。